logo CVRV
Centrum výskumu rastlinnej výroby
Bratislavská cesta 122
921 68 Piešťany
e-mail: hudcovicova@vurv.sk
 
 


Molekulárna diagnostika patogéna Drechslera tritici-repentis pomocou PCR

Rastliny sú počas vegetačného obdobia v poľných podmienkach ovplyvňované množstvom faktorov prostredia. Interakcie, ktoré vznikajú kombináciou viacerých nepriaznivých faktorov sa na rastlinách prejavujú rôznymi spôsobmi. Najčastejšími prejavmi sú chlorotické, či nekrotické škvrny spôsobované hubovými chorobami. Avšak podobné prejavy na rastlinách pšenice sú spôsobované aj fyziologicko-environmentálnymi stresmi. Keďže v poľných podmienkach je často veľmi komplikované správne diagnostikovať pôvodcu symptómov, je nevyhnutné používať najmodernejšie metódy diagnostiky.

Počas posledných rokov sa v pestovateľských oblastiach pšenice nielen u nás ale aj vo svete zvyšuje škodlivosť viacerých listových škvrnitostí. Opakované pestovanie pšenice spôsobuje častý výskyt chorôb, čo sa odráža v kvantitatívnych aj kvalitatívnych stratách na úrode zrna, ako aj zmenou farby, vzniku pachutí a zápachu najmä pri náchylných odrodách. Naopak, pri použití vyšších dávok a nesprávnej aplikácii fungicídov môže dôjsť ku chemickej kontaminácii, čiže k ukladaniu toxických rezíduí v rastlinných produktoch.

Jednou z týchto listových škvrnitostí je helmintosporióza pšenice alebo hnedá škvrnitosť listov pšenice, ktorú spôsobuje hubový patogén Drechslera tritici-repentis (Died.) Shoem. (Shoemaker 1962) (telemorfa Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drech.). Táto choroba napáda predovšetkým listový aparát (obr. 1), čím znižuje fotosyntetickú plochu listov a spôsobuje redukciu nalievania zrna, nižší počet zŕn v klase a nižšiu úrodu, najmä vtedy, ak sú silno infikované horné dva listy, predposledný a vlajkový list.

Obr. 1: Symptómy napadnutia patogénom Drechslera tritici repentis na listoch pšenice letnej f. ozimná

Choroba spôsobuje priemerné zníženie úrody o 5-10%, avšak za priaznivých podmienok pre rozvoj choroby môžu byť tieto straty aj viac ako 50%. Choroba z celosvetového hľadiska patrí k najzávažnejším patogénom pšenice. Najvýznamnejšia je v USA, Kanade, ale v posledných niekoľkých rokoch sa stáva aktuálnym problémom aj v Európskych krajinách.

Včasná, rýchla a presná diagnostika tohto patogéna v rôznych vývojových štádiách rastliny je dôležitá nielen pri ochrane porastov, ale aj pri zabezpečovaní kvalitných a zdravotne nezávadných potravinárskych výrobkov, nakoľko patogén Drechslera tritici-repentis počas infekcie rastliny produkuje aj toxické látky. Diagnostika tohto patogéna nie je jednoduchá vzhľadom na jeho enormnú variabilitu v morfológii, fyziológii a patogenicite, ako aj vzhľadom na to, že na základe vizuálnych symptómov je ťažko odlíšiteľný od ďalších patogénov napádajúcich pšenicu, ale aj od symptómov neparazitárneho pôvodu.

Najcitlivejšie, najpresnejšie a najrýchlejšie diagnostické testy patogénov sú založené na princípe detekcie prítomnosti DNA patogéna v rastline, resp. semene pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). PCR metódy už boli použité pri diagnostikovaní viacerých patogénov na rôznych druhoch plodín, pričom využitie PCR metód v rastlinolekárstve umožňuje rýchlu a presnú diagnostiku patogénov v rôznych vývojových štádiách rastliny už pred objavením sa prvých symptómov ochorenia. V prípade patogéna Drechslera tritici-repentis boli DNA analýzy zatiaľ úspešne použité len na detekciu vnútrodruhovej genetickej diverzity medzi jeho izolátmi. Preto bola práca v laboratóriách CVRV Piešťany zameraná na vytvorenie špecifického DNA primera pre molekulárnu diagnostiku tohto patogéna v rastlinnom materiáli pomocou PCR.

V rokoch 2005-2008 sme izolovali 13 izolátov Drechslera tritici-repentis z primárnych listov pšenice zozbieraných z rôznych oblastí Slovenska, jeden izolát z Českej republiky a 10 izolátov z Fínska. Následne sme navrhli PCR primer na detekciu tohto patogéna. Po optimalizácii podmienok PCR reakcie sme dokázali, že primer amplifikuje fragment o veľkosti 382 bp pri testovaných izolátoch Drechslera tritici-repentis. Špecifitu tohto primeru sme testovali amplifikáciou s DNA rôznych hubových patogénov ako aj s DNA zo zdravých listov pšenice. K amplifikácii PCR produktu nedošlo ani pri DNA iných patogénov, ani pri DNA zo zdravých listov pšenice (obr. 2).

Obr. 2: Amplifikácia patogénnej DNA pomocou nami navrhnutého primeru. Dráha 1. ladder 50 bp, 2. Drechslera tritici repentis (SVK), 3. Drechslera tritici repentis (SVK), 4. negatívna kontrola, 5. Drechslera tritici repentis (Fínsko), 6. Pyrenophora graminea, 7.-10. Pyrenophora teres, 11.-12. Septoria tritici, 13.-15. Stagonospora nodorum (SVK + Fínsko), 16.-18. Rhynchosporium secalis, 19. Fusarium graminearum, 20. Fusarium poe, 21. Fusarium culmorum 22. zdravé listy pšenice

Primer sme úspešne použili aj na detekciu patogéna Drechslera tritici-repentis v umelo infikovaných listoch pšenice 11 dní po inokulácii, ako aj v prirodzene infikovaných zrnách pšenice z poľných podmienok. Špecifický primer správne amplifikoval diagnostický band o veľkosti 382 bp v infikovaných listoch aj zrnách (obr. 3).

Obr. 3: Amplifikácia patogénnej DNA pomocou nami navrhnutého primeru. Dráha 1. Drechslera tritici repentis (SVK), 2. ladder 25 bp, 3. negatívna kontrola, 4.- 7. listy pšenice umelo infikované patogénom Drechslera tritici repentis, 8.-11. zrná pšenice prirodzene infikované patogénom Drechslera tritici repentis

Na základe našich výsledkov sme vytvorili metódu, ktorej prednosťou je presná druhovo špecifická detekcia patogéna Drechslera tritici-repentis spôsobujúceho helmintosporiózu pšenice a jeho odlíšenie od iných významných patogénov pomocou PCR. Spoľahlivá diagnostika iba podľa symptómov na listoch môže byť pri pôsobení viacerých faktorov niekedy zavádzajúca a aj skúsený fytopatológ sa môže pomýliť.

Ďalšou významnou prednosťou metódy je zistenie prítomnosti patogéna už v skorých fázach infekcie, ešte pred objavením sa prvých symptómov, ako aj diagnostika v zrne. Táto metóda umožňuje monitorovať stav priebehu rastlinnej výroby a umožňuje pripraviť zásahy smerujúce k ochrane porastov a k zlepšeniu zdravotných parametrov primárnych produktov rastlinnej výroby. Výsledky analýz sú uplatniteľné v efektívnej kontrole chorôb, v racionálnom použití fungicídov (znížená, resp. riadená spotreba agrochemikálií sa prejaví v zníženej kontaminácii primárnych rastlinných produktov ich rezíduami) a tiež v kontrole primárnych poľnohospodárskych produktov vstupujúcich ako základná surovina do výroby potravín a krmív.

Uvedená metóda je dobre aplikovateľná pre rutinné využitie, pričom analýza od prijatia vzorky do laboratória, cez extrakciu DNA až po samotné stanovenie prítomnosti patogéna trvá iba 2 - 3 dni.

Vystavené 8 3.2011

Autori textu: Mgr. Martina Hudcovicová, PhD.; Ing. Jozef Gubiš, PhD.